Materiał cytologiczny z moczu do diagnostyki FISH

Materiał cytologiczny z moczu do diagnostyki FISH można przygotować na 2 sposoby.

Metoda 1.  CytoSpin / utrwalanie w etanolu.

1. Procedura

• Zebrać 25 ml moczu.
• Utrwalić przez noc w 4°C przy użyciu 25 ml 50% etanolu.

2. Przygotowanie próbki

• Odwirować utrwalone komórki w etanolu przez 10 minut przy 2000 rpm w temperaturze pokojowej.
• Zlać supernatant.
• Ponowne zawiesić osad komórkowy w 1 ml 1x PBS.

3. Przygotowanie preparatu mikroskopowego

• Przygotować oznaczone, odtłuszczone i suche szkiełko.
• Zmontować szkiełko z kominkiem i filterkiem (elementy potrzebne do wirowania w wirówce cytologicznej).
• 100-200 µl próbki umieścić w kominku.
• Wirować w wirówce cytologicznej przez 10 min przy 40xg w temperaturze pokojowej.

Z powodu sił kapilarnych próbka wchodzi do pojemnika dopiero po przyłożeniu siły odśrodkowej. Zawieszone komórki docierają do szklanej powierzchni i przylegają do niej. Nadmiar płynu jest absorbowany przez filterek.

• Ostrożnie rozmontować kominek i filterek od szkiełka.

Unikać rozmazania komórek.

• Natychmiast utrwalić komórki, stosując spray utrwalający (np. Thermo Scientific™ Shandon™ Cell-Fixx™ Spray Fixative).
• Wysuszyć preparat przez 10 min.
• Preparaty można przechowywać w -20°C.

Metoda 2. Utrwalanie w metanolu / kwasie octowym (alternatywnie).

1. Przygotowanie materiału.

• Zebrać ≥33 ml moczu.
• Wymieszać mocz w stosunku 2:1 (v:v) z utrwalaczem (np. Carbowax) lub 1:1 (v:v) z Shandon™ Cytospin™ Collection Fluid.

2. Opracowanie próbki.

• Odwirować w 600xg przez 10 min w temperaturze pokojowej w probówkach typu Falcon 50 ml.
• Zlać nasącz pozostawiając ok. 1-2 ml osadu komórek.
• Zawiesić osad komórkowy w pozostałych 1-2 ml supernatantu i przenieść do probówki 15 ml.
• Odwirować w 600xg przez 10 min w temperaturze pokojowej.
• Zlać nasącz pozostawiając ok. 0,5 ml osadu komórek.
• Zawiesić osad komórkowy w pozostałych 0,5 ml supernatantu.
• Stopniowo dodać 1-5 ml świeżego utrwalacza (3:1, metanol : kwas octowy), najpierw kroplami z częstą agitacją.
• Pozostawić utrwalone próbki przez 30 min w -20°C.
• Odwirować w 600xg przez 5 min w temperaturze pokojowej.
• Ostrożnie zlać supernatant.
• Przepłukać osad 1-5 ml utrwalacza (3:1, metanol : kwas octowy).
• Odwirować w 600xg przez 5 min w temperaturze pokojowej.
• Powtórzyć ten krok płukania jeszcze 2x.
• Jeśli osad komórkowy jest prawie niewidoczny, po odwirowaniu osadu komórkowego w utrwalaczu, ostrożnie usunąć możliwie jak najwięcej utrwalacza, pozostawiając ok. 100 µl roztworu.
• Jeśli osad komórkowy jest dobrze widoczny, usunąć jak najwięcej utrwalacza i dodać 0,5 - 1 ml świeżego utrwalacza do osadu komórkowego.
• Natychmiast przystąpić do przygotowania preparatów mikroskopowych.

3.  Przygotowanie preparatu mikroskopowego.

• Użyć szkiełka z naniesionymi oznaczeniami kołowymi.
• Zawiesić ponownie osad komórkowy i nałożyć 3 µl, 10 µl, 30 µl zawiesiny komórek na trzy kółka szkiełka (kółko 1, 2 i 3).
• Wysuszyć próbki na powietrzu.
• Zbadać szkiełko pod mikroskopem świetlnym, używając obiektywu 20x.
• Wybrać obszar hybrydyzacji (kółko 1, 2 i 3), w którym w polu widzenia widocznych jest 100-200 komórek.
• Do hybrydyzacji należy użyć koła o najlepszej odpowiedniej gęstości komórek.
• Jeśli gęstość komórek jest zbyt niska, zastosować kolejne 30 µl zawiesiny komórek.
• Jeśli gęstość komórek jest zbyt wysoka, rozcieńczyć zawiesinę komórek środkiem utrwalającym i powtórzyć procedurę przygotowania szkiełka.
• Utrwalone preparaty mikroskopowe są stabilne w temperaturze -20°C przez okres do 12 miesięcy.

Kolejne kroki należy przeprowadzić zgodnie z instrukcją zestawu ZytoLight FISH Cytology Implementation Kit.