Materiał cytologiczny z moczu do diagnostyki FISH

Materiał cytologiczny z moczu do diagnostyki FISH można przygotować na 2 sposoby.

 

Metoda 1.  CytoSpin / utrwalanie w etanolu.

 

  1. Procedura
  • Zebrać 25 ml moczu.
  • Utrwalić przez noc w 4°C przy użyciu 25 ml 50% etanolu.

 

  1. Przygotowanie próbki
  • Odwirować utrwalone komórki w etanolu przez 10 minut przy 2000 rpm w temperaturze pokojowej.
  • Zlać supernatant.
  • Ponowne zawiesić osad komórkowy w 1 ml 1x PBS.

 

  1. Przygotowanie preparatu mikroskopowego
  • Przygotować oznaczone, odtłuszczone i suche szkiełko.
  • Zmontować szkiełko z kominkiem i filterkiem (elementy potrzebne do wirowania w wirówce cytologicznej).
  • 100-200 µl próbki umieścić w kominku.
  • Wirować w wirówce cytologicznej przez 10 min przy 40xg w temperaturze pokojowej.

Z powodu sił kapilarnych próbka wchodzi do pojemnika dopiero po przyłożeniu siły odśrodkowej. Zawieszone komórki docierają do szklanej powierzchni i przylegają do niej. Nadmiar płynu jest absorbowany przez filterek.

  • Ostrożnie rozmontować kominek i filterek od szkiełka.

Unikać rozmazania komórek.

  • Natychmiast utrwalić komórki, stosując spray utrwalający (np. Thermo Scientific™ Shandon™ Cell-Fixx™ Spray Fixative).
  • Wysuszyć preparat przez 10 min.
  • Preparaty można przechowywać w -20°C.

 

Metoda 2. Utrwalanie w metanolu / kwasie octowym (alternatywnie).

  1. Przygotowanie materiału.
  • Zebrać ≥33 ml moczu.
  • Wymieszać mocz w stosunku 2:1 (v:v) z utrwalaczem (np. Carbowax) lub 1:1 (v:v) z Shandon™ Cytospin™ Collection Fluid.
  1. Opracowanie próbki.
  • Odwirować w 600xg przez 10 min w temperaturze pokojowej w probówkach typu Falcon 50 ml.
  • Zlać nasącz pozostawiając ok. 1-2 ml osadu komórek.
  • Zawiesić osad komórkowy w pozostałych 1-2 ml supernatantu i przenieść do probówki 15 ml.
  • Odwirować w 600xg przez 10 min w temperaturze pokojowej.
  • Zlać nasącz pozostawiając ok. 0,5 ml osadu komórek.
  • Zawiesić osad komórkowy w pozostałych 0,5 ml supernatantu.
  • Stopniowo dodać 1-5 ml świeżego utrwalacza (3:1, metanol : kwas octowy), najpierw kroplami z częstą agitacją.
  • Pozostawić utrwalone próbki przez 30 min w -20°C.
  • Odwirować w 600xg przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  • Ostrożnie zlać supernatant.
  • Przepłukać osad 1-5 ml utrwalacza (3:1, metanol : kwas octowy).
  • Odwirować w 600xg przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  • Powtórzyć ten krok płukania jeszcze 2x.
  • Jeśli osad komórkowy jest prawie niewidoczny, po odwirowaniu osadu komórkowego w utrwalaczu, ostrożnie usunąć możliwie jak najwięcej utrwalacza, pozostawiając ok. 100 µl roztworu.
  • Jeśli osad komórkowy jest dobrze widoczny, usunąć jak najwięcej utrwalacza i dodać 0,5 - 1 ml świeżego utrwalacza do osadu komórkowego.
  • Natychmiast przystąpić do przygotowania preparatów mikroskopowych.
  1.  Przygotowanie preparatu mikroskopowego.
  • Użyć szkiełka z naniesionymi oznaczeniami kołowymi.
  • Zawiesić ponownie osad komórkowy i nałożyć 3 µl, 10 µl, 30 µl zawiesiny komórek na trzy kółka szkiełka (kółko 1, 2 i 3).
  • Wysuszyć próbki na powietrzu.
  • Zbadać szkiełko pod mikroskopem świetlnym, używając obiektywu 20x.
  • Wybrać obszar hybrydyzacji (kółko 1, 2 i 3), w którym w polu widzenia widocznych jest 100-200 komórek.
  • Do hybrydyzacji należy użyć koła o najlepszej odpowiedniej gęstości komórek.
  • Jeśli gęstość komórek jest zbyt niska, zastosować kolejne 30 µl zawiesiny komórek.
  • Jeśli gęstość komórek jest zbyt wysoka, rozcieńczyć zawiesinę komórek środkiem utrwalającym i powtórzyć procedurę przygotowania szkiełka.
  • Utrwalone preparaty mikroskopowe są stabilne w temperaturze -20°C przez okres do 12 miesięcy.

 

Kolejne kroki należy przeprowadzić zgodnie z instrukcją zestawu ZytoLight FISH Cytology Implementation Kit.

Ta strona wykorzystuje pliki cookies. Dowiedz się wiecej Pliki cookies to niewielkie pliki tekstowe przechowywane przez przeglądarkę internetową na urządzeniu użytkownika) m.in. do analizy statystycznej ruchu, dopasowania wyglądu i treści strony do indywidualnych potrzeb użytkownika. Pozostawiając w ustawieniach przeglądarki włączoną obsługę plików cookies wyrażasz zgodę na ich użycie. Jeśli nie zgadzasz się na wykorzystanie plików cookies zmień ustawienia swojej przeglądarki. Akceptuję